直接培養法檢測細胞培養中的支原體污染

特點

最直接最靈敏的檢測手段。

缺點

培養時間長,需3-5周才能判斷。有些支原體不能在培養基上培養出來(例如M. hyorhinis)。需要同時培養支原體菌株作陽性對照,可能會造成污染。

材料

葡萄糖、L-鹽酸精氨酸、Difco PPLO broth(Difco 0554-17-1)、馬血清、15%酵母膏溶液(高壓滅菌)、Bacto agar、無菌有蓋螺旋試管(高壓滅菌)、無菌培養皿(60x15mm)、玻璃棒、37℃培養箱、厭氧缸(厭氧缸長期培養易有污染,所以厭氧包應該用無菌水,每次打開厭氧缸后用70%酒精擦拭內壁。)

培養基準備: 基本配方為Difco PPLO broth(60%),馬血清(20%),15%酵母膏溶液(10%),10x儲存液(10%)。由于培養時間長,可加50u/ml青霉素至10x儲存液或加入乙酸鉈(1:2000)至培養基中以防止其他細菌的污染。

10x儲存液(1升): 稱取50克葡萄糖,10克L-鹽酸精氨酸溶于1升蒸餾水中。用0.22μm無菌過濾膜過濾除菌,分裝100ml至瓶中,-70℃保存。

液體培養基(1升): 稱取21克Difco PPLO broth,0.02克酚紅于600ml蒸餾水中加熱攪拌溶解。滅菌121℃15分鐘滅菌。待溫度降低至室溫后于無菌操作臺內加入200ml馬血清,100ml 15%酵母膏溶液及100ml解凍的10x儲存液,混合均勻后分裝至已滅菌的有蓋螺旋試管中,10ml/管。4℃保存,保存期限為1個月。

固體培養基: 稱取21克Difco PPLO broth,0.02克酚紅,15克Bacto agar于600ml蒸餾水中,加熱溶解。121℃15分鐘滅菌,放入50℃水浴中,待溫度降至50℃時于無菌超凈臺內加入200ml馬血清,100ml 15%酵母膏溶液及解凍的10x儲存液,混合均勻后倒入60x15mm無菌培養皿中,5ml/皿。保存于4℃,期限為1個月。

步驟

取1ml細胞培養液或0.2ml細胞懸浮液接種于液體培養基中,置于37℃培養2周,觀察是否有渾濁或pH變化。培養一周及兩周后,分別取0.1ml液體培養液涂于瓊脂平板上,倒置于厭氧缸中,37℃培養至少3周,持續觀察是否有支原體菌落出現。

另取1ml細胞培養液或0.2ml細胞懸浮液涂于瓊脂平板上,37℃厭氧培養3周,持續觀察是否有支原體菌落出現。

另作正負對照組,正對照為Acholeplasma laidlawii(ATCC 23206)與M. arginini(ATCC 23838)。負對照組為待測細胞的新鮮培養液。

結果判斷

支原體生長較慢,所以先在液體培養基中培養1-2周增殖后再培養于瓊脂平板上,至少培養3周后才能斷定是否有支原體污染。所以總個測試要5周才知道正確結果。

典型的支原體菌落是荷包蛋形,是由于支原體網瓊脂下層生長所致,為無色透明菌落,大小約為10-55μm 。但是并非所有支原體都是荷包蛋菌落,有些是圓形或類似黏菌類形態。

區分細胞或是氣泡造成的類似菌落,可將其自瓊脂平板上切下,重新培養于液體培養基中,培養一周后再接種入瓊脂平板,細胞和菌落則不會生長。

* 本文內容主要來自臺灣國家衛生研究院細胞庫

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